»BioFLOW«

Biofilm-assoziierte Infektionen stellen nicht nur im Gesundheitswesen, sondern auch in der Landwirtschaft eine große Gefahr dar. Im klinischen Umfeld sind Biofilme für bis zu 80 % der bakteriellen Infektionen beim Menschen verantwortlich, darunter chronische Lungeninfektionen bei Patienten mit zystischer Fibrose (CF), chronische Wunden sowie Infektionen an medizinischen Implantaten und Geräten. Innerhalb von Biofilmen sind die Zellen in eine dichte extrazelluläre Matrix eingebettet, die das Eindringen von Antibiotika behindert und sie vor der Immunabwehr des Wirts schützt. Zudem versagen die meisten Antibiotika bei der Eliminierung von Persister-Zellen, die eine Subpopulation in der inneren Biofilmschicht bilden, da viele ihrer molekularen Zielstrukturen während der Ruhephase inaktiv sind. Dies führt dazu, dass die in den Biofilm eingebetteten Zellen gegenüber antimikrobiellen Wirkstoffen 10- bis 1.000-mal resistenter sind als in ihrem planktonischen Zustand.

Im Agrarsektor spielen Biofilme auch bei Pflanzenkrankheiten eine entscheidende Rolle. So bildet beispielsweise Xylella fastidiosa, ein phytopathogenes Bakterium, das das Xylem von Pflanzen besiedelt, Biofilme im Inneren der Pflanzengefäße. Dies führt zu einer Blockade des Wasser- und Nährstofftransports und letztlich zum Absterben der Wirtspflanzen. Es hat ein breites Wirtsspektrum, befällt über 700 Pflanzenarten und verursacht schwere Krankheiten, darunter das Oliven-Schnellverfallssyndrom, die Pierce-Krankheit bei Weinreben und die Mandelblattverbrennung. Trotz der enormen wirtschaftlichen Verluste, die durch diesen Phytopathogen verursacht werden, gibt es noch immer kein bekanntes Heilmittel, was die dringende Notwendigkeit unterstreicht, neue Behandlungsmöglichkeiten für diese biofilmbedingte Infektion zu finden.

Ziel dieses Projekts ist die Entwicklung eines physiologisch relevanten mikrofluidischen Biofilm-Screening-Assays, der die Strömungsbedingungen in vivo nachahmt, wobei der Schwerpunkt auf Xylella fastidiosa liegt. Der etablierte Assay ermöglicht die Echtzeitüberwachung der Biofilmbildung, der Behandlung (einschließlich struktureller Zerstörung und Lebensfähigkeit) sowie eines möglichen erneuten Wachstums unter kontrollierten hydrodynamischen Bedingungen. 

Da Xylella fastidiosa ein langsam wachsendes Bakterium mit einer typischen In-vitro-Biofilmbildungsdauer von 8–14 Tagen ist, haben wir in der anfänglichen Entwicklungsphase den schnell wachsenden, klinisch relevanten Erreger Pseudomonas aeruginosa als Modellorganismus verwendet, um eine schnellere Optimierung und Fertigstellung des Assay-Workflows zu ermöglichen.

Nachdem die Robustheit des Assays validiert worden war, passten wir die Assay-Parameter für Xylella fastidiosa an. Schließlich wurden die etablierten Plattformen genutzt, um sowohl handelsübliche Antibiotika als auch neu entdeckte Naturstoffe zu bewerten. In diesem Zusammenhang stellt die umfangreiche Stammsammlung des Fraunhofer IME Gießen eine wertvolle Quelle bioaktiver Verbindungen dar, die als neue Anti-Biofilm-Wirkstoffe dienen könnten. Der Screening-Workflow beginnt mit einem Primärscreening unter Verwendung statischer, mikroplattenbasierter Biofilm-Eradikationsassays, um die gleichzeitige Prüfung mehrerer Verbindungen und Konzentrationen zu ermöglichen. Vielversprechende Kandidaten aus dem ersten Screening werden anschließend mithilfe des mikrofluidischen Modells weiter evaluiert, um ihre Anti-Biofilm-Aktivität unter hydrodynamischen Bedingungen zu bewerten. 

Das Projekt wird in drei Phasen durchgeführt:

Entwicklung und Validierung des mikrofluidischen Biofilm-Screening-Assays unter Verwendung eines schnell wachsenden Stammes

• In der ersten Entwicklungsphase verwendeten wir den schnell wachsenden Stamm Pseudomonas aeruginosa als Modellorganismus, um den Arbeitsablauf schneller zu optimieren. Diese Arbeit mündete in einer Veröffentlichung, in der die Robustheit der Plattform nachgewiesen wurde, einschließlich der Implementierung sequenzieller Mehrfachdosierungen zur Verbesserung der Wirkstoffexposition im Zeitverlauf.

Übertragung des mikrofluidischen Assays auf Xylella fastidiosa

• In dieser Phase wird der mikrofluidische Assay an den Phytopathogen Xylella fastidiosa angepasst. Diese Übertragung erforderte eine Optimierung der Durchflussrate, der Langzeitkultivierung des Biofilms und der Behandlungsdauer.

Screening antimikrobieller Verbindungen mittels des mikrofluidischen Assays gegen Xylella fastidiosa-Biofilme

• Der etablierte mikrofluidische Assay wird anschließend für das Screening antimikrobieller Verbindungen eingesetzt, um deren Potenzial als Kandidaten für die Biofilmhemmung zu untersuchen. Nach dem Primärscreening mittels statischer mikroplattenbasierter Assays werden vielversprechende Treffer dann mithilfe des mikrofluidischen Modells weiter evaluiert, um ihre Biofilmhemmungsaktivität unter hydrodynamischen Bedingungen zu bewerten. 

Der etablierte Arbeitsablauf für P. aeruginosa wurde genutzt, um die Anti-Biofilm-Aktivität von Colistin und Darobactin B – einem vielversprechenden präklinischen Antibiotika-Kandidaten mit einzigartigem Wirkmechanismus – zu bewerten, wobei die Robustheit der Plattform beim Nachweis sowohl unmittelbarer als auch langfristiger Behandlungseffekte unter Beweis gestellt wurde.

Durch die Übertragung dieser Technologie auf Xylella fastidiosa wird der entwickelte, in vivo-ähnliche Assay dazu beitragen, die Übertragungsrate positiver Ergebnisse aus Primärassays zu verbessern, und als Grundlage für in vivo- oder in planta-Experimente dienen. Die Integration dieses Assays in die laufenden Hochdurchsatz-Pipelines zur Entdeckung von Naturstoffen kann die Wahrscheinlichkeit erhöhen, eine dringend benötigte Behandlungsoption für xylemassoziierte Biofilm-Infektionen zu finden.

Einer der Hauptvorteile des mikrofluidischen Ansatzes besteht darin, dass dieser Assay im Vergleich zu herkömmlichen In-vivo- oder In-planta-Assays eine geringere Menge an Testverbindung erfordert, wodurch er sich für die Prüfung von Naturstoffen im Frühstadium mit geringem Verbrauch an Wirkstoffen eignet. Die mikrofluidische Plattform bietet somit eine physiologisch relevante und ressourcenschonende Strategie für die Biofilmforschung und die Entdeckung antimikrobieller Wirkstoffe. Darüber hinaus bildet der Workflow mit mehreren Dosierungen eine Grundlage für die Entwicklung von Dosierungsschemata für bioaktive Verbindungen sowohl in der medizinischen als auch in der landwirtschaftlichen Anwendung.