Pathogendiagnostik

Pflanzenschädlinge und Krankheitserreger stellen weltweit eine große Bedrohung für die Pflanzenproduktion dar. Diese hat in den letzten Jahren dramatisch zugenommen. Globalisierung, Handel und Klimawandel spielen hierbei eine wichtige Rolle. Die FAO schätzte im Jahr 2019, das jährlich zwischen 20 und 40 Prozent der weltweiten Pflanzenproduktion durch Schädlinge verloren gehen. So kosten Pflanzenkrankheiten die Weltwirtschaft jedes Jahr rund 220 Milliarden US Dollar. Die Schäden werden durch Krankheitserreger aus der Gruppe der Bakterien, Pilze, Insekten und Viren hervorgerufen.

Klassische Methoden zur Identifizierung der Pflanzenpathogene sind die Beobachtung von Symptomen sowie die Kultivierung der Schaderreger für die morphologische Identifizierung mit Hilfe der Mikroskopie. Heutzutage weit verbreitete Diagnoseverfahren basieren auf immunologischen Technologien wie zum Beispiel dem Enzymimmunoassay (ELISA) oder dem Lateral Flow Immunoassay (LFIA). In Laboren setzen sich verstärkt Nukleinsäure-basierte Methoden zum Nachweis und zur Identifizierung der Krankheitserreger durch. Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und ihre Varianten sind in der Regel sehr spezifisch und sensitiv, zudem relativ schnell und kostengünstig, weisen aber dennoch einige Nachteile auf, da eine spezielle Ausrüstung und geschultes Personal erforderlich sind.

Um Pflanzenkrankheiten und die Ausbreitung der Pathogene in neue Gebiete zu kontrollieren und möglichst zu verhindern, ist es jedoch zwingend erforderlich, Methoden zur Früherkennung, die vor-Ort im Feld eingesetzt werden können, zu entwickeln. Für die Realisierung solcher Point-of-Care Diagnostik ist das Zusammenspiel folgender Eigenschaften Bedingung: Hohe Spezifität, Empfindlichkeit, Reproduzierbarkeit, Schnelligkeit, Kosteneffizienz und Multiplex-Nachweisfähigkeit gepaart/kombiniert mit einfacher Handhabung, so dass wenig geschultes Personal die Tests durchführen kann ohne spezielle Laborgeräte nutzen zu müssen.

Technologien, die auf der isothermen Amplifikation der Nukleinsäuren basieren, wie die schleifenvermittelte isotherme Amplifikation (loop-mediated isothermal amplification LAMP) erfüllen optimal diese Anforderungen an die Point-of-Care Diagnostik.
Daher fokussiert die Abteilung Funktionelle und Angewandte Genomik die FuE Arbeiten zur PoC-Diagnostik von Pflanzenpathogenen auf diese Technologie.

Virendiagnostik

Viren sind eine der Hauptursachen von Pflanzenkrankheiten, sie machen fast 50 Prozent der Pathogene aus, die weltweit für neu oder wieder auftretende Pflanzenkrankheiten verantwortlich sind. Die wirtschaftlichen Folgen werden auf mehr als 30 Milliarden Dollar jährlich geschätzt. Sind Pflanzen von Viren befallen, können sie nicht durch Pflanzenschutzmitteln bekämpft werden. Bei ausgeprägtem Befall einer Anbaufläche bleibt meist nur die Verbrennung der betroffenen Pflanzen. Die Eindämmung von Pflanzenvirosen konzentriert sich daher auf vorbeugende Maßnahmen wie regelmäßi-ge Kontrolle der Anbauflächen, eindeutige Quarantänebestimmungen, Unterbrechung der Infektionsketten und Verwendung von Virus-freiem Saat- und Pflanzgut. Die Point-of-Care Diagnostik von Pflanzenviren weiter voranzutreiben, kommt somit eine besonders große Bedeutung zu. Obwohl bereits mehrere, meist auf Antikörpern basierende Methoden für die Diagnose von Pflanzenviren entwickelt wurden, erschwert die enorme Variabilität der Genome von Pflanzenviren selbst innerhalb einer einzigen Virusfamilie ihren genauen und zuverlässigen Nachweis. Darüber hinaus ist der gleichzeitige Nachweis von Pflanzen, die mit mehreren verschiedenen Viren infiziert sind, in einem Schritt mit handelsüblichen Diagnosekits aufgrund der Beschränkungen der zugrunde liegenden Biochemie nach wie vor eine Herausforderung, wenn nicht sogar unmöglich.

Schnelltest für Kartoffelviren Viren bedrohen die Kartoffelernte – Innovationen zum einfachen Nachweis sind dringend erforderlich

Die Kartoffel ist ein wichtiges Grundnahrungsmittel sowohl in Industrie- als auch in Entwicklungsländern. Kartoffelpflanzen sind jedoch anfällig für eine Vielzahl wirtschaftlich relevanter Viren, die die Knollenqualität beeinträchtigen und die Erträge um bis zu 50 Prozent reduzieren.

© BNA | Johannes Pawlik
Mit dem Kartoffel Virus Y infizierte Knolle.
© BNA | Johannes Pawlik
Querschnitt durch eine mit TRV infizierte Karoffelknolle.

Eine der größten Bedrohungen stellt die viröse Eisenfleckigkeit dar: Eine Knollennekrose, die durch das Tabak-Rattle-Virus (TRV) verursacht und durch Nematoden übertragen wird. An der Oberfläche der Kartoffelknollen treten nekrotische Flecken auf. In den Knollen findet sich meist ringförmiges korkiges, nekrotisches Gewebe. Die Ausprägung dieser Symptome in den Knollen führt dazu, dass ca. 45 Prozent der betroffenen Knollen in Qualität und Wert herabgestuft werden, während ca. 55 Prozent als unverkäuflich deklariert werden.

Der Nachweis der Kartoffelviren erfordert in der Regel die Einsendung der Feldproben an spezialisierte Labore zur Nukleinsäureextraktion, gefolgt von einer RT-PCR (Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion). Die anschließende kolorimetrische schleifenvermittelte isothermale Amplifikation (LAMP) wird abschließend durch eine Lateral-Flow-Dipstick-Analyse (LFD) visualisiert.

Nach Optimierung des Mini-LAMP-LFD-Ansatzes für den empfindlichen und spezifischen Nachweis von TRV, verifizierten wir die Zuverlässigkeit und Robustheit dieses Ansatzes durch den gleichzeitigen Nachweis von TRV und anderen schädlichen Viren in Duplex-LAMP-Reaktionen.
Ein großer Vorteil der Methode: Sie ist ohne größere technische Hilfsmittel, wie PCR-Cycler, außerhalb spezialisierter Labore möglich. Unser neuer Ansatz bietet so Züchtern, Produzenten und Landwirten eine kostengünstige und effiziente neue Plattform für das Krankheitsmanagement sowohl in der Kartoffelzucht als auch im Kartoffelanbau.

Ausgewählte Publikation

Edgü, G., Freund, L.J., Hartje, S., Tacke, E., Hofferbert, H.-R., Twyman, R.M., Noll, G.A., Muth, J., Prüfer, D.
Fast, precise, and reliable multiplex detection of potato viruses by loop-mediated isothermal amplification (2020) Int. J. Mol. Sci. 21 (22), 8741: 1-19. DOI