Die cis-Prenyltransferase-Proteinfamilie in Taraxacum koksaghyz

Boje Müller

        »Als erste umfassende Analyse der gesamten cis-Prenyltransferase-Familie von T. koksaghyz in vivo liefert unsere Arbeit beispiellose Einblicke in die Regulation des Isoprenoidstoffwechsels in dieser Naturkautschuk-produzierenden Spezies. Unsere Studie unterstreicht die Spezialisierung des Kautschuk-Transferase-Komplexes und ebnet den Weg für die zielgerichtete Entwicklung verbesserter Enzyme.«

Mit mehreren 10.000 Verbindungen bilden Isoprenoide eine der größten Gruppen pflanzlicher Sekundärmetabolite. Ihre Struktur entsteht durch die Aneinanderreihung der C5-IsopreneinheitIsopentenyldiphosphat (IPP). Die Isoprenoid-Synthese wird durch die Kondensation von IPP mit seinem Isomer Dimethylallylphosphat (DMAPP) initiiert. Durch aufeinanderfolgende Kopf-zu-Schwanz-Additionen von IPP entstehen längerkettige lineare Polyisoprenoide. Die sequenzielle Übertragung von IPP-Einheiten auf allylische Diphosphat-Akzeptoren wird durch eine Klasse von Enzymen katalysiert, die als Prenyltransferasen bekannt sind. Je nach Stereochemie des Polyisoprenoid-Produkts werden diese Enzyme entweder als trans-Prenyltransferasen (transPTs) oder als cis-Prenyltransferasen (cisPTs) klassifiziert.

Die Forschenden charakterisierten die Familie der acht cis-Prenyltransferasen in Taraxacum koksaghyz (TkCPT1–8), um ihre Expression, subzelluläre Lokalisierung, Wechselwirkungen mit TkCPTL-Proteinen (cis prenyltransferase like, CPTL) und physiologischen Funktionen besser zu verstehen.
Mittels qRT-PCR wurden mRNA-Expressionsprofile von TkCPT1–8 erstellt, die zeigen, dass die mRNAs von TkCPT1 und TkCPT2 am häufigsten im Latex vorkamen, während die mRNAs von TkCPT3 und TkCPT6–8 überwiegend in den Blättern auftraten. TkCPT3 wurde stärker exprimiert als TkCPT6–8. TkCPT4 wurde konstitutiv in allen Geweben in geringen Mengen exprimiert. Die TkCPT5-mRNA konnte dagegen nur in Blüten in hohen Konzentrationen nachgewiesen werden. Für die Untersuchungen der subzellulären Lokalisation wählten die Forschenden die transiente Co-Expression mit spezifischen fluoreszenzmarkierten Proteinen in Nicotiana benthamiana Epidermiszellen. Die Auswertung mittels Konfokaler-Laser-Scanning-Mikroskopie ergab, dass TkCPT1–4 im Endoplasmatischen Retikulum, während TkCPT5–7 in den Chloroplasten lokalisiert sind.
Die Interaktions-Analysen mit TkCPTL-Proteinen erfolgten ebenfalls in Nicotiana benthamiana mittels bimolekularer Fluoreszenzkomplementierung. Ein Fluorophor (mRFP) wird in zwei nicht fluoreszierende Hälften gespalten, die zur Markierung der potentiellen Interaktionspartner verwendet werden. Interagieren die Proteine miteinander, lagern sich die beiden Hälften des Flurophors (mRFP) aneinander und fluoreszieren bei Anregung mit grünem Licht rot. Die Koexpression von TkCPT3 oder TkCPT4, je mit einer Hälfte mRFP fusioniert, mit TkCPTL1 oder TkCPTL2, fusioniert mit der jeweils anderen Hälfte, führte zu einer stark roten Fluoreszenz. Dies deutet darauf hin, dass sowohl TkCPT3 als auch TkCPT4 mit TkCPTL1/TkCPTL2 interagieren. Für TkCPT5–8 zeigten die Forschenden, dass keine Interaktion mit TkCPTL1/TkCPTL2 stattfindet. Für alle Enzyme konnte im rekombinanten System Hefe die Produktion unterschiedlicher linearer Isoprenoide nachgewiesen werden. TkCPT1 und TkCPT2 bilden zusammen mit TkCPTL1 Polyisoprenoide, TkCPT3 und TkCPT4 (mit TkCPTL1) erzeugen kurzkettigere Polyisoprenoide, die durch andere Enzyme in Dolichole umgewandelt werden. TkCPT5 produziert Pentaprenol, TkCPT6 Nonaprenol sowie TkCPT7 und 8 Nerol.