Protein Engineering

Unser langfristiges Forschungsziel ist es im Detail zu verstehen, wie Proteine im zellulären Kontext interagieren und wie diese Interaktionen in erkrankten Zellen zu medizinischen Zwecken moduliert werden können. Um dieses Ziel zu erreichen, konstruieren wir Affinitätsreagenzien, die spezifisch und mit hoher Affinität ihr Zielmolekül (Antigen) binden und dadurch seine Funktion beeinflussen. Zur Konstruktion dieser Affinitätsreagenzien verfolgen wir einen struktur-basierten Protein Design Ansatz. Dazu werden bis zu zehn Milliarden unabhängige Varianten mit Hilfe von Phagen-Display nach geeigneten Eigenschaften durchforstet. Die so erstellten Affinitätsreagenzien finden vielfältige Anwendung in der Erforschung, Diagnose und Therapie von neurodegenerativen und entzündlichen Erkrankungen.

© Wiechmann S, Gärtner A, Kniss A, Stengl A, Behrends C, Rogov VV, Rodriguez MS, Dötsch V, Müller S, Ernst A.*

SUMO2 als graue Schleife. Die numerierten Sphären repräsentieren zufällige Positionen in drei verschieden Regionen (Orange, Violett, Türkis). Adaptiert von Wiechmann & Gärtner et al., 2017.

Intrazelluläre Inhibitoren

Wir entwickeln intrazelluläre Affinitätsreagenzien/Inhibitoren basierend auf Ubiquitin und Ubiquitin-ähnlichen Proteinen (UbiL-Ins). Unter Verwendung eines strukturgeleiteten Ansatzes und »Phage-Displays« führen wir Oberflächenmodifikationen ein, um die intermolekularen Wechselwirkungen/Kontakte zu verschiedenen intrazellulären Zielproteinen zu optimieren. Dieser Prozess liefert hochselektive Inhibitoren mit verbesserter Affinität und Spezifität. Bisher wurden mehrere Inhibitoren von Proteinen im Ubiquitin-Proteasom-System (DUBs, E3s und lineare Bindungsmotive) etabliert (Ernst et al., 2013). In laufenden Forschungsprojekten haben wir diese Engineering-Pipeline auf andere Proteine mit einer Ubiquitin-ähnlichen Faltung erweitert:

- SUMO1 und 2, die in DNA-Reparatur und Ribosom-Biogenese involviert sind

- LC3B, das sowohl in selektive als auch in nichtspezifische Autophagozytose Prozesse involviert ist

- Ubiquitin ähnliche Effektor-Domänen, die kleine GTPasen aus der Ras-Superfamilie als Ziel haben

© Fraunhofer IME, Goethe-Universität | Andreas Ernst und Mateusz Putyrski

IgG Schema. Leichte Kette (in blau) und schwere Kette (in grün).

Antikörper Engineering

Wir konstruierten unsere eigene kombinatorische synthetische Fab-Bibliothek mit bis zu 10 Milliarden verschiedenen Antikörperfragmenten. Diese Bibliothek wurde mittlerweile erfolgreich verwendet, um hochaffine Binder zu isolieren, die für verschiedene intra- und extrazelluläre Proteine ​​spezifisch sind. Zum Beispiel haben wir Antikörper entwickelt, die die Aktivität eines neuen Mitglieds der Interleukin-1-Familie von Zytokinen neutralisieren. Unsere Pipeline umfasst die Selektion von Phagen, die bakterielle Expression von Fab-Fragmenten und deren Charakterisierung sowie die Produktion von Volllängen-IgGs in Säugetierzellkulturen.

Zytokin Engineering

Zytokine sind extrazelluläre Mediatoren, die die Funktion des Immunsystems steuern. Ihre Aktivität unterliegt einer engen räumlichen und zeitlichen Kontrolle, so dass die biologisch aktiven Moleküle nur eine relativ kurze Serumhalbwertszeit aufweisen. Dies wiederum begrenzt die Verwendung exogener Zytokinpräparate als Therapeutika. Unser Ziel ist die Entwicklung von Zytokinen mit optimierter Stabilität und verbesserten biologischen Halbwertszeit. Durch die Stabilisierung von IL-1-Mitgliedern, versuchen wir neuartige Therapeutika zur Behandlung von Autoimmunkrankheiten und Krebs zu etablieren.

Canny, M.D., Moatti, N., Wan, L.C.K., Fradet-Turcotte, A., Krasner, D., Mateos-Gomez, P.A., Zimmermann, M., Orthwein, A., Juang, Y.-C., Zhang, W., Noordermeer, S.M., Seclen, E., Wilson, M.D., Vorobyov, A., Munro, M., Ernst, A., Ng, T.F., Cho, T., Cannon, P.M., Sidhu, S.S., Sicheri, F., Durocher, D. Inhibition of 53BP1 favors homology-dependent DNA repair and increases CRISPR-Cas9 genome-editing efficiency (2018) Nature Biotechnology, 36 (1), 95-102. https://doi.org/10.1038/nbt.4021

 

Manczyk, N., Yates, B.P., Veggiani, G., Ernst, A., Sicheri, F., Sidhu, S.S. Structural and functional characterization of a ubiquitin variant engineered for tight and specific binding to an alpha-helical ubiquitin interacting motif (2017) Protein Science, 26 (5), 1060-1069. https://doi.org/10.1002/pro.3155

Stolz, A., Putyrski, M., Kutle, I., Huber, J., Wang, C., Major, V., Sidhu, S.S., Youle, R.J., Rogov, V.V., Dötsch, V., Ernst, A., Dikic, I. Fluorescence-based ATG8 sensors monitor localization and function of LC3/GABARAP proteins (2017) EMBO Journal, 36 (4), 549-564. https://doi.org/10.15252/embj.201695063

Wiechmann, S., Ernst, A. Engineering of intracellular modulators [Engineering von intrazellulären Modulatoren] (2017) BioSpektrum, 23 (7), 769-771. https://doi.org/10.1007/s12268-017-0870-9

Wiechmann, S., Gärtner, A., Kniss, A., Stengl, A., Behrends, C., Rogov, V.V., Rodriguez, M.S., Dötsch, V., Müller, S., Ernst, A. Site-specific inhibition of the small ubiquitin-like modifier (SUMO)-conjugating enzyme Ubc9 selectively impairs SUMO chain formation (2017) Journal of Biological Chemistry, 292 (37), 15340-15351. https://doi.org/10.1074/jbc.M117.794255

Zhang, W., Sartori, M.A., Makhnevych, T., Federowicz, K.E., Dong, X., Liu, L., Nim, S., Dong, A., Yang, J., Li, Y., Haddad, D., Ernst, A., Heerding, D., Tong, Y., Moffat, J., Sidhu, S.S. Generation and Validation of Intracellular Ubiquitin Variant Inhibitors for USP7 and USP10 (2017) Journal of Molecular Biology, 429 (22), 3546-3560. https://doi.org/10.1016/j.jmb.2017.05.025

 

Mora, J., Schlemmer, A., Wittig, I., Richter, F., Putyrski, M., Frank, A.-C., Han, Y., Jung, M., Ernst, A., Weigert, A., Brüne, B. Interleukin-38 is released from apoptotic cells to limit inflammatory macrophage responses (2016) Journal of Molecular Cell Biology, 8 (5), 426-438. https://doi.org/10.1093/jmcb/mjw006

 

Ernst, A., Appleton, B.A., Ivarsson, Y., Zhang, Y., Gfeller, D., Wiesmann, C., Sidhu, S.S. A structural portrait of the PDZ domain family (2014) Journal of Molecular Biology, 426 (21), 3509-3519. https://doi.org/10.1016/j.jmb.2014.08.012

Gfeller, D., Ernst, A., Jarvik, N., Sidhu, S.S., Bader, G.D. Prediction and experimental characterization of nsSNPs altering human PDZ-binding motifs (2014) PLoS ONE, 9 (4), art. no. e94507. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0094507

Stolz, A., Ernst, A., Dikic, I. Cargo recognition and trafficking in selective autophagy (2014) Nature Cell Biology, 16 (6), 495-501. https://doi.org/10.1038/ncb2979

 

Ernst, A., Avvakumov, G., Tong, J., Fan, Y., Zhao, Y., Alberts, P., Persaud, A., Walker, J.R., Neculai, A.-M., Neculai, D., Vorobyov, A., Garg, P., Beatty, L., Chan, P.-K., Juang, Y.-C., Landry, M.-C., Yeh, C., Zeqiraj, E., Karamboulas, K., Allali-Hassani, A., Vedadi, M., Tyers, M., Moffat, J., Sicheri, F., Pelletier, L., Durocher, D., Raught, B., Rotin, D., Yang, J., Moran, M.F., Dhe-Paganon, S., Sidhu, S.S. A strategy for modulation of enzymes in the ubiquitin system (2013) Science, 339 (6119), 590-595. https://doi.org/10.1126/science.1230161

Ernst, A., Sidhu, S.S. Engineering ubiquitin to modulate the ubiquitin proteosome system (2013) Cell Cycle, 12 (11), 1651-1652. https://doi.org/10.4161/cc.24985

 

Gfeller, D., Butty, F., Wierzbicka, M., Verschueren, E., Vanhee, P., Huang, H., Ernst, A., Dar, N., Stagljar, I., Serrano, L., Sidhu, S.S., Bader, G.D., Kim, P.M. The multiple-specificity landscape of modular peptide recognition domains (2011) Molecular Systems Biology, 7, art. no. 484. https://doi.org/10.1038/msb.2011.18

 

Ernst, A., Gfeller, D., Kan, Z., Seshagiri, S., Kim, P.M., Bader, G.D., Sidhu, S.S. Coevolution of PDZ domain-ligand interactions analyzed by high-throughput phage display and deep sequencing (2010) Molecular BioSystems, 6 (10), 1782-1790. https://doi.org/10.1039/c0mb00061b

 

Ernst, A., Sazinsky, S.L., Hui, S., Currell, B., Dharsee, M., Seshagiri, S., Bader, G.D., Sidhu, S.S. Rapid evolution of functional complexity in a domain family (2009) Science Signaling, 2 (87). https://doi.org/10.1126/scisignal.2000416

 

Matsuura, T., Ernst, A., Zechel, D.L., Plückthun, A. Combinatorial approaches to novel proteins (2004) ChemBioChem, 5 (2), 177-182. https://doi.org/10.1002/cbic.200300755

 

Matsuura, T., Ernst, A., Plückthun, A. Construction and characterization of protein libraries composed of secondary structure modules (2002) Protein Science, 11 (11), 2631-2643. https://doi.org/10.1110/ps.0215102

* Diese Abbildung wurde ursprünglich im Journal of Biological Chemistry publiziert. Wiechmann S, Gärtner A, Kniss A, Stengl A, Behrends C, Rogov VV, Rodriguez MS, Dötsch V, Müller S, Ernst A. Site-specific inhibition of the small ubiquitin-like modifier (SUMO)-conjugating enzyme Ubc9 selectively impairs SUMO chain formation. J. Biol. Chem. 2017; 292 (37): 15340-15351.